【實驗原理】
還原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的單糖和某些二糖（如乳糖和麥芽糖）。在堿性溶液中，還原糖能將Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag等金屬離子還原，而糖本身被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。糖類的這種性質(zhì)常被用于糖的定性和定量測定。
直接滴定法即費林試劑熱滴定法。費林試劑由甲溶液和乙溶液組成。甲溶液含硫酸銅和亞甲基藍（氧化還原指示劑）;乙溶液含氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉和亞鐵氰化鉀。將一定量的甲溶液和乙溶液等體積混合時，硫酸銅與氫氧化鈉反應(yīng)，生成氫氧化銅沉淀，在堿性溶液中，所生成的氫氧化銅沉淀與酒石酸鈉反應(yīng)，生成可溶性的酒石酸鉀鈉銅絡(luò)合物。

在加熱條件下，用樣液滴定，樣液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應(yīng)，酒石酸鉀鈉銅被還原糖還原，產(chǎn)生紅色氧化亞銅沉淀、反應(yīng)生成的氧化亞銅沉淀與費林試劑中的亞鐵氰化鉀（黃血鹽）反應(yīng)生成可溶性復(fù)鹽，便于觀察滴定終點。
滴定時以亞甲基藍為氧化-還原指示劑。因為亞甲基藍氧化能力比二價銅弱，待二價銅離子全部被還原后，稍過量的還原糖可使藍色的氧化型亞甲基藍還原為無色的還原型的亞甲基藍，即達滴定終點。根據(jù)樣液量可計算出還原糖含量。
本方法測定的是一大類具有還原性的糖，包括葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖等，只是結(jié)果用葡萄糖或轉(zhuǎn)化糖表示而已。
 
本法又稱快速法，是目前最常用的測定還原糖的方法，也是國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法。優(yōu)點是試劑用量少、操作簡單、快速、滴定終點明顯，適用于各類樣品中還原糖的測定。缺點是對深色樣品因色素干擾使終點難以判斷，從而影響其準(zhǔn)確性。
5 分析步驟


5.1 試樣制備


5.1.1 含淀粉的食品:稱取粉碎或混勻后的試樣10g~20g(精確至0.001g),置250mL容量瓶中,加
水200mL,在45℃水浴中加熱1h,并時時振搖,冷卻后加水至刻度,混勻,靜置,沉淀。吸取200.0mL
上清液置于另一250mL容量瓶中,緩慢加入乙酸鋅溶液 5mL和亞鐵氰化鉀溶液5mL,加水至刻度,混勻,靜置30min,用干燥濾紙過濾,棄去初濾液,取后續(xù)濾液備用。


5.1.2 酒精飲料:稱取混勻后的試樣100g(精確至0.01g),置于蒸發(fā)皿中,用氫氧化鈉溶液中和至中
性,在水浴上蒸發(fā)至原體積的1/4后,移入250mL容量瓶中,緩慢加入乙酸鋅溶液5mL和亞鐵氰化鉀溶液5mL,加水至刻度,混勻,靜置30min,用干燥濾紙過濾,棄去初濾液,取后續(xù)濾液備用。


5.1.3 碳酸飲料:稱取混勻后的試樣100g(精確至0.01g)于蒸發(fā)皿中,在水浴上微熱攪拌除去二氧化碳后,移入250mL容量瓶中,用水洗滌蒸發(fā)皿,洗液并入容量瓶,加水至刻度,混勻后備用。


5.1.4 其他食品:稱取粉碎后的固體試樣2.5g~5g(精確至0.001g)或混勻后的液體試樣5g~25g
(精確至0.001g),置250mL容量瓶中,加50mL水,緩慢加入乙酸鋅溶液5mL 和亞鐵氰化鉀溶液
5mL,加水至刻度,混勻,靜置30min,用干燥濾紙過濾,棄去初濾液,取后續(xù)濾液備用。


5.3 試樣溶液預(yù)測
吸取堿性酒石酸銅甲液5.0mL和堿性酒石酸銅乙液5.0mL于150mL錐形瓶中,加水10mL,加
入玻璃珠2粒~4粒,控制在2min內(nèi)加熱至沸,保持沸騰以先快后慢的速度,從滴定管中滴加試樣溶
液,并保持沸騰狀態(tài),待溶液顏色變淺時,以1滴/2s的速度滴定,直至溶液藍色剛好褪去為終點,記錄樣品溶液消耗體積。
 
注:當(dāng)樣液中還原糖濃度過高時,應(yīng)適當(dāng)稀釋后再進行正式測定,使每次滴定消耗樣液的體積控制在與標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液時所消耗的還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積相近,約10mL左右,結(jié)果按式(1)計算;當(dāng)濃度過低時則采取直接加入10mL 樣品液,免去加水10mL,再用還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點,記錄消耗的體積與標(biāo)定時消耗的還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積之差相當(dāng)于10mL 樣液中所含還原糖的量,結(jié)果按式(2)計算。


5.4 試樣溶液測定
吸取堿性酒石酸銅甲液5.0mL和堿性酒石酸銅乙液5.0mL,置于150mL錐形瓶中,加水10mL,加
入玻璃珠2粒~4粒,從滴定管滴加比預(yù)測體積少1mL的試樣溶液至錐形瓶中,控制在2min內(nèi)加熱至沸,保持沸騰繼續(xù)以1滴/2s的速度滴定,直至藍色剛好褪去為終點,記錄樣液消耗體積,同法平行操作三份,得出平均消耗體積(V)。


6 分析結(jié)果的表述
試樣中還原糖的含量(以某種還原糖計)按式(1)計算:
 
式中:
X ———試樣中還原糖的含量(以某種還原糖計),單位為克每百克(g/100g);
m1 ———堿性酒石酸銅溶液(甲、乙液各半)相當(dāng)于某種還原糖的質(zhì)量,單位為毫克(mg);
m ———試樣質(zhì)量,單位為克(g);
F ———系數(shù),對5.1.1、5.1.3、5.1.4為1;5.1.2為0.80;
V ———測定時平均消耗試樣溶液體積,單位為毫升(mL);
250 ———定容體積,單位毫升(mL);
1000———換算系數(shù)。
當(dāng)濃度過低時,試樣中還原糖的含量(以某種還原糖計)按式(2)計算:
 
式中:
X ———試樣中還原糖的含量(以某種還原糖計),單位為克每百克(g/100g);
m2 ———標(biāo)定時體積與加入樣品后消耗的還原糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積之差相當(dāng)于某種還原糖的質(zhì)量,單位為毫克(mg);
m ———試樣質(zhì)量,單位為克(g);
F ———系數(shù),對5.1.1、5.1.3、5.1.4為1;5.1.2為0.80;
10 ———樣液體積,單位毫升(mL);
250 ———定容體積,單位毫升(mL );
1000———換算系數(shù)。
還原糖含量≥10g/100g時,計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字;還原糖含量<10g/100g 時,計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。
7 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的5%。
8 其他
當(dāng)稱樣量為5g時,定量限為0.25g/100g。


【注意事項】
1.費林試劑甲液和乙液應(yīng)分別儲存，用時才混合，否則酒石酸鉀鈉銅絡(luò)合物長期在堿性條件下會慢慢分解析出氧化亞銅沉淀，使試劑有效濃度降低。
2. 滴定必須是在沸騰條件下進行，其原因一是加快還原糖與Cu2+的反應(yīng)速度；二是亞甲基藍的變色反應(yīng)是可逆的，還原型的亞甲基藍會被空氣中的氧氧化為氧化型。此外，氧化亞銅也極不穩(wěn)定，易被空氣中的氧所氧化。保持反應(yīng)液沸騰可防止空氣進入，避免亞甲基藍和氧化亞銅被氧化而增加消耗量。
3. 滴定時不能隨意搖動錐形瓶，更不能把錐形瓶從熱源上取下來滴定，以防止空氣進入反應(yīng)溶液中。


以上實驗方法僅供參考，具體可參考此國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)要求操作或根據(jù)自身行業(yè)標(biāo)注要求操作。