試劑盒組成 組分 50 次 100 次 Buffer Digestion 24 ml 48 ml Buffer PY 12 ml 24 ml TE Buffer (pH 8.0) 10 ml 20 ml Snailase Reaction Buffer 60 ml 120 ml Snailase Storage Buffer 5 ml 10 ml Snailase 600 mg 1200 mg 操作手冊(cè) 1 份 1 份 保

存方法及注意事項(xiàng) 本試劑盒于常溫運(yùn)輸，Snailase 請(qǐng)于-20°C 保存，其它組分室溫保存，有效期見包裝。
Buffer Digestion 中含有刺激性化合物，操作過(guò)程中應(yīng)穿上實(shí)驗(yàn)服，戴好乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，防止 吸入口鼻。沾染皮膚或眼睛后，請(qǐng)立即用清水或生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)生的幫助。
產(chǎn)品介紹 本試劑盒無(wú)需使用苯酚、氯仿等有毒試劑。
從 2 ml 酵母菌液可以獲得 5~10 μg DNA，OD260/OD280 比值一般為 1.7~1.9 之間。抽提出的 DNA 可用于酶切、PCR、文庫(kù)構(gòu)建、Southern blot 等相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟 自備材料：水浴鍋、小型高速離心機(jī)（最大離心力 ≥ 12,000 × g）、1.5 ml 離心管、75%乙醇、異丙醇、β-巰基乙醇等。
Buffer Digestion 在低溫下可能產(chǎn)生沉淀，使用前請(qǐng)檢查，如有沉淀，請(qǐng)于 65°C 溶解沉淀后使用。
Snailase 比較難溶解，請(qǐng)?zhí)崆皩?Snailase 加入 Snailase Storage Buffer，渦旋混勻使酶溶解，如溶解不完全，可以將 Snailase 置于冰箱 4 °C 過(guò)夜溶解。待完全溶解后分裝，-20°C 冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 提前將水浴鍋調(diào)至 65°C 備用。
1. 細(xì)胞和細(xì)胞核的裂解：取1~2 ml過(guò)夜培養(yǎng)的酵母菌液，加入1.5 ml離心管中，室溫10,000 rpm離心1 min，棄上清，收 集菌體。 ü 1 ml 過(guò)夜培養(yǎng)的酵母培養(yǎng)物離心收集，濕重約為 20 mg。
2. 酵母細(xì)胞壁的去除：按每20 mg菌體濕重取600 μl Snailase Reaction Buffer加入步驟1中的離心管，同時(shí)加入2.4 μl β-巰 基乙醇和50 μl實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備好的Snailase，37°C水浴3 h。室溫10,000 rpm離心2 min，棄上清。 ü 酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)堅(jiān)韌，若想破壁完全，可以增加 Snailase 的用量或延長(zhǎng)破壁時(shí)間，可以 37°C 水浴過(guò)夜。
3. 加入400 μl Digestion Buffer，震蕩混勻。65°C水浴1 h至細(xì)胞完全裂解。 ü水浴過(guò)程中，每 10 min 顛倒混勻一次，可促進(jìn)樣品裂解。 如需得到無(wú) RNA 的 DNA，可在水浴后加入 20 μl 的 RNase A（10 mg/ml），室溫放置 2~5 min。
4. 加入200 μl Buffer PY，充分顛倒混勻，-20°C冰箱放置5 min。
5. 室溫10,000 rpm離心5 min，將上清液（約500~550 μl）轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管中。 若上清液混濁，可再加入等體積氯仿混勻，12,000 rpm 離心取上清。
6. 加入等體積的異丙醇，顛倒5~8次使之混勻，室溫放置2~3 min。室溫10,000 rpm離心5 min，棄上清。
7. 加入1 ml 75%乙醇，顛倒漂洗1~3 min，10,000 rpm離心2 min，棄上清。 ü 漂洗時(shí)一定要使沉淀懸浮起來(lái)。
8. 重復(fù)步驟7一次。
9. 開蓋室溫倒置5~10 min至殘留的乙醇完全揮發(fā)。  此步絕不可省略，否則殘余的乙醇會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。  如果殘留的乙醇有掛壁現(xiàn)象，倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。然后開蓋室溫放置 5~10min 至殘留的乙 醇完全揮發(fā)。
10. 得到的DNA用50~100 μl TE Buffer溶解。提取的DNA可立即進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或-20°C保存。 TE Buffer 為 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA, pH 8.0