EHA101：                                                                  100μl/支
pK7WGF2（control vector，10ng/μl )                            10μl
保存條件(保質(zhì)期)：                                         -80℃（12個(gè)月） 
 基因型
C58 (rif^R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kan^R) Nopaline
產(chǎn)品說(shuō)明
EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：kan，賦予EHA101菌株和卡那霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。本公司生產(chǎn)的EHA101化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pK7WGF2質(zhì)粒（壯觀霉素抗性）檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>10⁴ cfu/μg DNA。
操作方法
1. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。
2.每100 μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（轉(zhuǎn)化效率較高，第一次使用前最好做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量），用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。
3. 加入700 μl無(wú)抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天。
（當(dāng)平板只含有轉(zhuǎn)化所用雙元載體抗生素時(shí)，28℃培養(yǎng)48小時(shí)即可；平板中同時(shí)加入雙元載體抗生素，20 μg/ml rif 時(shí)，需28℃培養(yǎng)60小時(shí)；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90小時(shí)）。
 
備注
1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

抗生素	配方	原液	工作液
羧芐青霉素（carb）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
硫酸卡那霉素（kan）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
鏈霉素（strep）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	10 mg/ml	50 μg/ml
利福平（rif）	DMSO溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	10 mg/ml	20 μg/ml
慶大霉素（gent）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌	20 mg/ml	40 μg/ml

2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

農(nóng)桿菌菌株	羧芐青霉素(carb)	鏈霉素(strep)	利福平(rif)	慶大霉素(gent)	硫酸卡那霉素(kan)
AGL-1	R	S	R	S	S
EHA101	S	S	R	S	R
EHA105	S	S	R	S	S
LBA4404	S	R	R	S	S
GV3101	S	S	R	R	S

3、LB及YEB配方：
 

component	LB(液體)/L	LB(固體)/L	component	YEB(液體)/L	YEB(固體)/L
Tryptone	10 g	10 g	Tryptone	5 g	5 g
Yeast extract	5 g	5 g	Yeast extract	1 g	1 g
NaCl	10 g	10 g	牛肉浸膏	5 g	5 g
NaOH	調(diào)PH到7.0	調(diào)PH到7.0	蔗糖	5 g	5 g
Agar	－	15 g	MgSO4*7H2O	0.49 g	0.49 g
			NaOH	調(diào)PH到7.0	調(diào)PH到7.0
			Agar	－	15 g

注意事項(xiàng)
1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。
2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽(yáng)性克隆密度過(guò)大時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)不足，陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量。
4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml，過(guò)高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司EHA101感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有50 μg/ml 壯觀霉素，若所用平板同時(shí)含有20 μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。
5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮這些抗生素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。