GV3101(pSoup-p19)：100μl/支  
pGs2（controlvector，10ng/μl)10μl  
保存條件(保質(zhì)期)：-80℃（12個月）  
基因型  
C58(rifR)TipMP90(pTiC58DT-DNA)(gentR)Nopaline(pSoup-p19-tetR)  
產(chǎn)品說明  
p19蛋白來源于番茄叢矮病毒，可抑制宿主對外源基因的RNA沉默效應，提高異源基因轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，進而促進異源蛋白的表達，廣泛應用于轉(zhuǎn)基因植物及煙草葉片，擬南芥葉片，番茄葉片或原生質(zhì)體的瞬時表達系統(tǒng)中。GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti質(zhì)粒含有篩選標簽：gent，賦予GV3101菌株慶大霉素抗性；在GV3101菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒：pSoup-p19即為GV3101(pSoup-p19)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2等質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復制，同時賦予該菌株四環(huán)素（tet）抗性。適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作。本公司生產(chǎn)的GV3101(pSoup-p19)化學轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pGs2(卡那霉素抗性)質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>103cfu/μgDNA。  
操作方法  
1.取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。  
2.每100μl感受態(tài)加入0.01-1μg質(zhì)粒DNA（轉(zhuǎn)化效率較高，第一次使用前最好做預實驗確定所加質(zhì)粒的量），用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。  
3.加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。  
4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當平板只含有50μg/mlkan時，28℃培養(yǎng)48h即可；平板中同時加入50μg/mlkan，20μg/mlrif時，需28℃培養(yǎng)60h；如果使用的平板含有50μg/mlrif則需要28℃培養(yǎng)72-90h）。  
注意事項  
1.加入質(zhì)粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。  
2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量，本公司生產(chǎn)的GV3101(pSoup-p19)化學轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞具有四環(huán)素抗性，但在轉(zhuǎn)入目標質(zhì)粒涂板篩選陽性克隆時，只需加入目標質(zhì)?？剐缘目股?，不加四環(huán)素。  
3.平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質(zhì)粒用量。  
4.利福平濃度不應高于25μg/ml，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。  
5.培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但鏈霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。
備注

1、農(nóng)桿菌相關抗生素配方：

抗生素	配方	原液	工作液
羧芐青霉素（carb）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
硫酸卡那霉素（kan）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
鏈霉素（strep）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	10 mg/ml	50 μg/ml
利福平（rif）	DMSO溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	10 mg/ml	20 μg/ml
慶大霉素（gent）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	20 mg/ml	40 μg/ml

 
2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

農(nóng)桿菌菌株	羧芐青霉素(carb)	鏈霉素(strep)	利福平(rif)	慶大霉素(gent)	硫酸卡那霉素(kan)
AGL-1	R	S	R	S	S
EHA101	S	S	R	S	R
EHA105	S	S	R	S	S
LBA4404	S	R	R	S	S
GV3101	S	S	R	R	S

3、LB及YEB配方：

component	LB(液體)/L	LB(固體)/L	component	YEB(液體)/L	YEB(固體)/L
Tryptone	10 g	10 g	Tryptone	5 g	5 g
Yeast extract	5 g	5 g	Yeast extract	1 g	1 g
NaCl	10 g	10 g	牛肉浸膏	5 g	5 g
NaOH	調(diào)PH到7.0	調(diào)PH到7.0	蔗糖	5 g	5 g
Agar	－	15 g	MgSO4*7H2O	0.49 g	0.49 g
			NaOH	調(diào)PH到7.0	調(diào)PH到7.0
			Agar	－	15 g